【摘要】 目的 探讨自身免疫性内耳病模型动物耳蜗热休克蛋白的表达。方法 利用同种异体内耳抗原免疫豚鼠，以建立自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease, AIED)动物模型，并应用免疫组织化学及原位杂位技术，研究热休克蛋白（heat shock protein, hsp)70在正常对照组及 AIED 模型动物实验组耳蜗中的表达情况。结果 对照组豚鼠螺旋神经节细胞中存在hsp70样蛋白基础表达；实验组28耳中10耳（35.7 ％）听阈提高≥10 dB；此组动物螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带hsp70及其mRNA表达明显增强。结论 以粗制膜迷路抗原免疫豚鼠，听阈提高动物hsp70在螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带合成增加。Expression of heat shock protein 70 in immune response of the guinea pig inner earYAN Zhen, GONG Shusheng, HUANG Xiaolin,et al. （Department of Otolaryngology,Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430022, China） Corresponding author：YAN Zhen (Email: yanzhen2000@sina.com) 【Abstract】 Objective To explore whether the immune response of the inner ear could induce heat shock protein (hsp) 70 in guinea pig cochlea.Methods A model of autoimmune inner ear disease (AIED) was established by systemically immunizing the guinea pig with the homologous crude inner ear antigen (CIEAg). The immunized cochleae and normal control cochleae were examined for the expression of hsp70 with techniques of immunohistochemistry and in situ hybridization. Results In the control animals, the expression of the hsp70-like protein appeared only in the spiral ganglion, whereas in the cochleae with CIEAg immunization, strong expression of the hsp70-like protein and its mRNA appeared in the spiral ganglion as well as in the stria vascularis and the spiral ligament. The hearing thresholds were significantly increased in 10 out of 28 cochleae (35.7%) with CIEAg immunization.Conclusion The results suggest that the immune response of the inner ear can induce the expression of hsp70 in the guinea pig cochlea. 【Key words】 Cochlea； Autoimmune diseases； Heat-Shock proteins； Disease models,animal； Hearing loss,sensorineural 确定与自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease,AIED)相关的内耳抗原对于阐明该病的发病机制非常必要。Harris 等［1］认为相对分子质量68 000膜迷路蛋白是一种内耳相关抗原。近来研究表明，68 000抗原可能为热休克蛋白（heat shock protein, hsp）70［2］。本研究应用同种异体粗制膜迷路抗原全身免疫豚鼠，以制作AIED动物模型， 并应用免疫组化及原位杂交等方法分析了模型动物耳蜗组织中hsp70的表达情况。 材料与方法 1. 实验动物：健康杂色豚鼠28 只，Preyer反射正常，体重250～350 g，雌雄兼有， 由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为实验组18只，对照组10只。动物麻醉用2%戊巴比妥钠，按30 mg/kg行腹腔注射。 2. 制备同种异体粗制膜迷路抗原：30只豚鼠，参照我们以前报道的方法［3］提取粗制膜迷路抗原,并在－70℃保存备用。 3. 免疫动物：实验组18 只豚鼠每只用200 μg/0.2 ml 粗制膜迷路抗原加等量完全弗氏佐剂（Sigma，美国）制成的乳化液行首次免疫。于左后足掌及腋窝皮下多点注射，以后每隔7～10 d，用粗制膜迷路抗原（首次用量的一半）加等量不完全弗氏佐剂（Sigma，美国）作加强注射，免疫部位同上，共加强7次。对照组动物仅在相应时间及相同部位注射等量完全及不完全弗氏佐剂。第7次加强注射后10 d，处死动物。 4. 听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）测试：所有受试动物在免疫前及免疫完成后1周均行ABR 测试。测试方法参照文献报道［3］。以ABR波Ⅲ反应阈为标准判断听阈。 5. 内耳冰冻切片制作：动物麻醉后快速断头，取出听泡，经4％多聚甲醛固定、10％EDTA-Na2脱钙后，OCT包埋标本，沿耳蜗中轴行冰冻切片，片厚10 μm，在-70℃保存标本。 6. 抗hsp70 抗体免疫组织化学染色：取实验组听阈提高超过10 dB 的10 耳，并随机选取实验组听阈无明显改变（听阈提高＜10 dB)的10耳以及对照组10耳耳蜗切片作免疫组化染色(SABC法）： 切片用0.3％甲醇-H2O2液处理；山羊血清封闭；加一抗（小鼠抗hsp70单克隆抗体1∶100, Sigma, 美国），37℃，孵育1h，并用普通小鼠IgG（1∶100，Sigma，美国）取代一抗作阴性对照；滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG，即用型）；切片与链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC)在37℃反应30 min；二氨基联苯胺显色，常规脱水、透明、中性树胶封片。上述试剂除特别注明外，均由武汉Boster公司提供。 免疫组化结果判定：观察hsp70在耳蜗组织细胞中的表达情况，综合显色细胞染色强度及比例分为：阴性（－）：无显色细胞；阳性（++）：组织或细胞胞浆呈棕黄色，较多量显色细胞；强阳性（+++）：组织或细胞胞浆呈深棕黄色，大量显色细胞；弱阳性（+）：介与（－）和（++）之间。 7. hsp70探针原位杂交：亦取上述30耳耳蜗（实验组20 耳, 其中听阈提高≥10 dB的 10耳，听阈提高＜10 dB的10耳；对照组10耳）切片作原位杂交。特异性hsp70寡核苷酸探针由上海Sangon公司合成，并在5'端标记地高辛，其序列为：3'-GG TAC CAC GAC TGG TTC TAC TTC CTC TAG C-5' 。杂交方法简述如下：①预杂交：切片依次用0.2 mol/L 盐酸、蛋白酶K(1 μg/ml，Sigma，美国)及0.2％甘氨酸处理后，逐级酒精(含0.3 mol/L乙酸铵)脱水，晾干，并加预杂交液(武汉Boster公司)，37 ℃，预杂交2 h；②杂交：切片上滴加杂交液(含2 μg/ml hsp70探针的预杂交液)，37 ℃，孵育17 h；③显色：切片经充分漂洗、封闭后，加碱性磷酸酶标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体(1∶200，Boehringer-Mannhim，德国)，37℃，孵育1 h；四唑氮蓝（nitroblue tetrazolium, NBT）、溴氯吲哚磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, BCIP）显色，常规脱水、透明、中性树胶封片。 原位杂交对照设置：①切片在杂交前用RNA 酶(200 μg/ml, Sigma,美国) 处理，37℃，30 min；②用不含探针的杂交液与切片孵育17 h。其它过程同上。 原位杂交结果判定：根据耳蜗组织细胞中hsp70 mRNA表达情况分为：阴性（－）：组织或细胞胞浆中无明显蓝紫色染色；阳性（+）：组织或细胞胞浆中出现蓝紫色染色。 结果 1. ABR 测听：实验组28 耳(18 只豚鼠，4 只因麻醉意外死亡)中，波Ⅲ反应阈10耳提高≥10 dB,18耳提高＜10 dB，听阈提高率为35.7％，其中2只动物双耳，6只动物单耳听阈提高。听阈提高10 dB者3耳，15 dB者4耳，20、25及40 dB者各1耳。经配对t检验发现，实验组免疫前后听阈差异有极显著性(P＜0.01)。对照组给药前后波Ⅲ反应阈无明显变化(P＞0.05) 。测听结果见表1。表1 豚鼠免疫前后ABR波Ⅲ反应阈(dB peSPL，±s)组 别 耳数 免疫前免疫完成后1 周P值实验组2844.6±4.354.1±9.3＜0.01对照组2044.5±3.944.5±4.3＞0.05 2. hsp70 免疫组织化学染色：免疫组化染色显示，hsp70样蛋白免疫阳性反应呈棕黄色，主要分布于组织或细胞胞浆，在耳蜗中的表达情况见表2。 对照组受检10耳中，有8耳次出现螺旋神经节细胞阳性染色（图1），但均呈弱阳性（+）表达。实验组听阈提高＜10 dB的受检10耳hsp70免疫组化染色结果与对照组基本一致。实验组听阈提高≥10 dB的10耳中，9耳螺旋神经节细胞有较强阳性反应（++ 3耳次，+++ 6耳次，图2），6耳血管纹及螺旋韧带中出现hsp70样阳性表达(+ 1耳次，++ 5耳次）。对各组hsp70样蛋白表达状况行统计学处理（Ridit分析），结果表明：hsp70在实验组听阈提高≥10 dB组螺旋神经节细胞中的表达显著高于实验组听阈提高＜10 dB组或对照组相应部位（P＜0.01)；听阈提高≥10 dB实验组血管纹及螺旋韧带hsp70样蛋白的表达与其它两组分别比较差异亦有显著性（P＜0.05)；而听阈提高＜10 dB的实验组与对照组相应部位hsp70表达差异无显著性（P＞0.05)。 图１ 对照组螺旋神经节细胞呈弱棕黄色阳性染色。hsp70单抗免疫组化染色SABC法×400 图2 实验组螺旋神经节细胞呈深棕黄色阳性染色.hsp70SABC法×400表2 各组耳蜗中hsp70样蛋白的表达情况（耳数）组别 检测耳数螺旋神经节细胞血管纹、螺旋韧带 -+++ +++-++++++对照组 10 2 80010000实验组听阈提高＜10 dB 10 0 100010000实验组听阈提高≥10 dB 10 0 1364150 3.hsp70探针原位杂交结果：hsp70 mRNA主要位于耳蜗组织或细胞胞浆中，其阳性反应呈蓝紫色。各组耳蜗hsp70 mRNA的表达情况见表3。表3 各组耳蜗中hsp70 mRNA的表达情况(耳数)组别检测耳数螺旋神经节细胞血管纹、 螺旋韧带 -+-+对照组10100100实验组听阈提高＜10 dB10100100实验组听阈提高≥10 dB102846 对照组及实验组听阈提高＜10 dB的螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带中，均未见hsp70 mRNA表达，而在听阈提高≥10 dB的实验组中，8耳出现螺旋神经节细胞hsp70 mRNA阳性反应（图3），6耳血管纹及螺旋韧带中出现阳性染色（图4）。对原位杂交资料进行统计学处理（Ridit分析），获得了与免疫组化相一致的结果。 图3 实验组螺旋神经节细胞胞浆中可见蓝紫色阳性染色．原位杂交×400 图4 实验组血管纹及螺旋韧带中可见蓝紫色阳性染色．原位杂交×400 当用不含hsp70 探针的杂交液与实验组切片孵育，或先将切片用RNA酶处理后再行杂交时，均未见阳性反应。 讨论 自McCabe 于 1979 年首次提出AIED 这一概念以来，大量内耳免疫的基础及临床研究已证实AIED 确为一独立存在的疾病。但由于内耳抗原组成复杂，究竟是何种内耳抗原与AIED发病有关，至今仍无定论。Harris等［1］首先在部分AIED患者血清中检出抗牛膜迷路68 000蛋白抗体，并发现该抗体阳性的AIED患者接受免疫抑制剂治疗可获良好疗效，故认为68 000膜迷路蛋白是一种内耳相关抗原。Billings等［2］进一步研究提出牛膜迷路68 000蛋白抗原可能为hsp70。 hsp是生物界进化最保守的成分，细菌与哺乳类hsp在结构，功能以及免疫原性等方面均有很高的相似性。应激状态时，hsp的细胞内合成增强。作为hsp家族成员之一的hsp70,其主要生理功能是作为“分子伴侣”(molecular chaperones)参与其它蛋白质的合成与成熟。在大多数正常细胞中，hsp70仅呈低水平表达［4］。本实验应用免疫组化证实未用膜迷路抗原免疫的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中存在hsp70样基础反应，但原位杂交却显示其耳蜗hsp70mRNA表达为阴性，表明未用膜迷路抗原免疫的豚鼠螺旋神经节细胞中hsp70本身的表达水平极低或无表达，邹静等［5］在正常豚鼠膜迷路中检出的68 000蛋白与Harris等［1］在牛膜迷路中检出的68 000蛋白可能不同，并非hsp70，但豚鼠螺旋神经节细胞中可能存在一些与hsp70有共同表位的小分子hsp基础表达［6］，这种表达为化脓性中耳炎诱发内耳自身免疫性损伤提供了物质基础：中耳细菌在感染过程中，其自身发生热休克反应，高表达hsp70［6］, 细菌hsp可经圆窗膜等途径侵入内耳［2］，诱导内耳局部产生抗细菌hsp的免疫应答，由于细菌hsp与哺乳类hsp具有交叉抗原性，故该反应可能导致表达hsp的耳蜗组织细胞（如螺旋神经节细胞）受损。 本组中实验组14只豚鼠有8只（10耳）听阈提高≥10 dB，听阈提高率为35.7%。免疫组化及原位杂交等实验结果提示hsp70（也可能包括与hsp70有共同表位的小分子hsp)在这些听阈提高≥10 dB的动物耳蜗中的表达呈明显增强趋势，这可能是由于利用同种异体粗制膜迷路抗原全身免疫豚鼠后，使其产生针对膜迷路的体液和/或细胞免疫反应［3］，当该反应发展到一定强度时，听功能下降，同时选择性激活细胞内的热休克基因，启动hsp大量合成。新合成的hsp70作为“分子伴侣”参与损伤细胞内的修复，清除细胞内变性蛋白，保护正常蛋白质［4］。本实验亦发现，在听阈提高≥10 dB的实验组动物耳蜗中，仅有螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带出现hsp70蛋白及其mRNA表达增强，说明耳蜗不同部位热休克反应启动的敏感性可能不同。实验组听阈提高＜10 dB组耳蜗的hsp70表达水平与对照组相比并无显著增高，其原因可能是内耳免疫反应强度尚未达到启动热休克基因的阈值，推测如果延长免疫时间，这些动物可能出现听力下降，并在其螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带中高表达hsp70。 AIED模型动物螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带中hsp70高水平表达是否会诱发针对耳蜗hsp的免疫应答，从而加重AIED的发展有待继续研究。 基金项目：湖北省卫生厅科学研究基金资助项目（W 98003) 通信作者：严臻 430063 武汉市杨园铁四院医院朱淑英转(Email: yanzhen2000@sina.com)参考文献 1，Harris JP,Sharp PA. Inner ear autoantibodies in patients with rapidly progressive sensorineural hearing loss. Laryngoscope, 1990,100:516-524. 2，Billings PB, Keithley EM, Harris JP. Evidence linking the 68 kilodalton antigen identified in progressive sensorineural hearing loss patient sera with heat shock protein 70. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995,104:181-188. 3，龚树生，汪吉宝. 自身免疫性内耳病的实验研究. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995,30:9-12. 4，Burel C, Mezger V, Pinto M, et al . Mammalian heat shock protein families . Expression and functions. Experientia , 1992 , 48 : 629-634. 5，邹静，姜泗长，顾瑞，等.自身免疫感音神经性耳聋血清抗膜迷路蛋白抗体的检测. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995,30:154-156. 6，邹静，姜泗长，周泳清，等. 实验性急性中耳细菌感染诱发的热休克反应.中华耳鼻咽喉科杂志，1998,33:282-284.(收稿日期：1999-10-27) 网友评论 | 医药网站导航 | 关于我们 | 觅医问药贴 | 医药分类信息 | 医院大全 | 药品大全 | 友情链接 | 询医问药| 网药®--耳鼻喉科网（专家咨询电话：0574-87086990 ）：请与我们联系 蜀ICP备05019257号,宁波中山医院耳鼻喉医疗中心 一次性 根治鼻息肉与治疗耳鸣最佳医院 互联网药品信息服务资格证书 编号：（川）-非经营性-2005-0007 Copyright ? 2005-2005 网药 All Rights Reserved.
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±s)组 别 耳数 免疫前免疫完成后1 周P值实验组2844.6±4.354.1±9.3＜0.01对照组2044.5±3.944.5±4.3＞0.05 2. hsp70 免疫组织化学染色：免疫组化染色显示，hsp70样蛋白免疫阳性反应呈棕黄色，主要分布于组织或细胞胞浆，在耳蜗中的表达情况见表2。 对照组受检10耳中，有8耳次出现螺旋神经节细胞阳性染色（图1），但均呈弱阳性（+）表达。实验组听阈提高＜10 dB的受检10耳hsp70免疫组化染色结果与对照组基本一致。实验组听阈提高≥10 dB的10耳中，9耳螺旋神经节细胞有较强阳性反应（++ 3耳次，+++ 6耳次，图2），6耳血管纹及螺旋韧带中出现hsp70样阳性表达(+ 1耳次，++ 5耳次）。对各组hsp70样蛋白表达状况行统计学处理（Ridit分析），结果表明：hsp70在实验组听阈提高≥10 dB组螺旋神经节细胞中的表达显著高于实验组听阈提高＜10 dB组或对照组相应部位（P＜0.01)；听阈提高≥10 dB实验组血管纹及螺旋韧带hsp70样蛋白的表达与其它两组分别比较差异亦有显著性（P＜0.05)；而听阈提高＜10 dB的实验组与对照组相应部位hsp70表达差异无显著性（P＞0.05)。
图１ 对照组螺旋神经节细胞呈弱棕黄色阳性染色。hsp70单抗免疫组化染色SABC法×400
图2 实验组螺旋神经节细胞呈深棕黄色阳性染色.hsp70SABC法×400表2 各组耳蜗中hsp70样蛋白的表达情况（耳数）组别 检测耳数螺旋神经节细胞血管纹、螺旋韧带 -+++ +++-++++++对照组 10 2 80010000实验组听阈提高＜10 dB 10 0 100010000实验组听阈提高≥10 dB 10 0 1364150 3.hsp70探针原位杂交结果：hsp70 mRNA主要位于耳蜗组织或细胞胞浆中，其阳性反应呈蓝紫色。各组耳蜗hsp70 mRNA的表达情况见表3。表3 各组耳蜗中hsp70 mRNA的表达情况(耳数)组别检测耳数螺旋神经节细胞血管纹、 螺旋韧带 -+-+对照组10100100实验组听阈提高＜10 dB10100100实验组听阈提高≥10 dB102846 对照组及实验组听阈提高＜10 dB的螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带中，均未见hsp70 mRNA表达，而在听阈提高≥10 dB的实验组中，8耳出现螺旋神经节细胞hsp70 mRNA阳性反应（图3），6耳血管纹及螺旋韧带中出现阳性染色（图4）。对原位杂交资料进行统计学处理（Ridit分析），获得了与免疫组化相一致的结果。 
图3 实验组螺旋神经节细胞胞浆中可见蓝紫色阳性染色．原位杂交×400
图4 实验组血管纹及螺旋韧带中可见蓝紫色阳性染色．原位杂交×400 当用不含hsp70 探针的杂交液与实验组切片孵育，或先将切片用RNA酶处理后再行杂交时，均未见阳性反应。 讨论 自McCabe 于 1979 年首次提出AIED 这一概念以来，大量内耳免疫的基础及临床研究已证实AIED 确为一独立存在的疾病。但由于内耳抗原组成复杂，究竟是何种内耳抗原与AIED发病有关，至今仍无定论。Harris等［1］首先在部分AIED患者血清中检出抗牛膜迷路68 000蛋白抗体，并发现该抗体阳性的AIED患者接受免疫抑制剂治疗可获良好疗效，故认为68 000膜迷路蛋白是一种内耳相关抗原。Billings等［2］进一步研究提出牛膜迷路68 000蛋白抗原可能为hsp70。 hsp是生物界进化最保守的成分，细菌与哺乳类hsp在结构，功能以及免疫原性等方面均有很高的相似性。应激状态时，hsp的细胞内合成增强。作为hsp家族成员之一的hsp70,其主要生理功能是作为“分子伴侣”(molecular chaperones)参与其它蛋白质的合成与成熟。在大多数正常细胞中，hsp70仅呈低水平表达［4］。本实验应用免疫组化证实未用膜迷路抗原免疫的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中存在hsp70样基础反应，但原位杂交却显示其耳蜗hsp70mRNA表达为阴性，表明未用膜迷路抗原免疫的豚鼠螺旋神经节细胞中hsp70本身的表达水平极低或无表达，邹静等［5］在正常豚鼠膜迷路中检出的68 000蛋白与Harris等［1］在牛膜迷路中检出的68 000蛋白可能不同，并非hsp70，但豚鼠螺旋神经节细胞中可能存在一些与hsp70有共同表位的小分子hsp基础表达［6］，这种表达为化脓性中耳炎诱发内耳自身免疫性损伤提供了物质基础：中耳细菌在感染过程中，其自身发生热休克反应，高表达hsp70［6］, 细菌hsp可经圆窗膜等途径侵入内耳［2］，诱导内耳局部产生抗细菌hsp的免疫应答，由于细菌hsp与哺乳类hsp具有交叉抗原性，故该反应可能导致表达hsp的耳蜗组织细胞（如螺旋神经节细胞）受损。 本组中实验组14只豚鼠有8只（10耳）听阈提高≥10 dB，听阈提高率为35.7%。免疫组化及原位杂交等实验结果提示hsp70（也可能包括与hsp70有共同表位的小分子hsp)在这些听阈提高≥10 dB的动物耳蜗中的表达呈明显增强趋势，这可能是由于利用同种异体粗制膜迷路抗原全身免疫豚鼠后，使其产生针对膜迷路的体液和/或细胞免疫反应［3］，当该反应发展到一定强度时，听功能下降，同时选择性激活细胞内的热休克基因，启动hsp大量合成。新合成的hsp70作为“分子伴侣”参与损伤细胞内的修复，清除细胞内变性蛋白，保护正常蛋白质［4］。本实验亦发现，在听阈提高≥10 dB的实验组动物耳蜗中，仅有螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带出现hsp70蛋白及其mRNA表达增强，说明耳蜗不同部位热休克反应启动的敏感性可能不同。实验组听阈提高＜10 dB组耳蜗的hsp70表达水平与对照组相比并无显著增高，其原因可能是内耳免疫反应强度尚未达到启动热休克基因的阈值，推测如果延长免疫时间，这些动物可能出现听力下降，并在其螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带中高表达hsp70。 AIED模型动物螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带中hsp70高水平表达是否会诱发针对耳蜗hsp的免疫应答，从而加重AIED的发展有待继续研究。 基金项目：湖北省卫生厅科学研究基金资助项目（W 98003) 通信作者：严臻 430063 武汉市杨园铁四院医院朱淑英转(Email: yanzhen2000@sina.com)参考文献 1，Harris JP,Sharp PA. Inner ear autoantibodies in patients with rapidly progressive sensorineural hearing loss. Laryngoscope, 1990,100:516-524. 2，Billings PB, Keithley EM, Harris JP. Evidence linking the 68 kilodalton antigen identified in progressive sensorineural hearing loss patient sera with heat shock protein 70. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995,104:181-188. 3，龚树生，汪吉宝. 自身免疫性内耳病的实验研究. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995,30:9-12. 4，Burel C, Mezger V, Pinto M, et al . Mammalian heat shock protein families . Expression and functions. Experientia , 1992 , 48 : 629-634. 5，邹静，姜泗长，顾瑞，等.自身免疫感音神经性耳聋血清抗膜迷路蛋白抗体的检测. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995,30:154-156. 6，邹静，姜泗长，周泳清，等. 实验性急性中耳细菌感染诱发的热休克反应.中华耳鼻咽喉科杂志，1998,33:282-284.(收稿日期：1999-10-27) 
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