逆转录病毒载体介导的HSV1-TK基因在人肾癌GRC-1细胞中的表达 中华泌尿外科杂志 2000年第3期第21卷 论著 作者：刘荣福 邵国兴 赵锦荣 缪军 刘凡 单位：刘荣福（西安，第四军医大学唐都医院泌尿外科 710038）；刘凡（西安，第四军医大学唐都医院泌尿外科 710038）；邵国兴（西京医院泌尿外科）；赵锦荣（生物技术中心）；缪军（寄生虫教研室） 关键词： 肾肿瘤；癌；基因 摘 要：目的 探讨HSV1-TK基因在人肾癌GRC-1细胞中表达的可能性及意义。方法 采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体G1Na-TK、用脂质体法对人肾癌GRC-1细胞进行转染及用新霉素(neomycin)筛选。结果 成功克隆出带HSV1-TK基因的GRC-1/TK细胞，并对无环鸟苷(ACV)敏感。结论 HSV1-TK基因可成功转染人肾癌GRC-1细胞，为基因治疗肾癌提供实验依据。 Expression of retrovirus-mediated HSV1-TK gene in human renal cancer cell line GRC-1 LIU Rongfu （Department of Urology,Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038,China） SHAO Guoxing （Department of Urology,Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038,China） ZHAO Jingrong （Department of Urology,Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038,China） Abstract：Objective To investigate the expression and significance of HSV1-TK gene in human renal cancer GRC-1 cells .Methods A retrovirus expression vector G1Na-TK was constructed with pgk-tk cDNA and a retroviral vector G1Na.The G1Na-TK vector was transfer into renal cancer GRC-1 cells with lipofectin reagent and the HSV-TK vector-producer cell line GRC-1/TK was isolated in 1mg/ml neomycin medium.Results The HSV-TK vector-producer cell line GRC-1/TK was obtained which confered a chemosensitivity to ACV.Conclusions HSV1-TK gene might be used in gene therapy of human renal cancer GRC-1 cells. Key words：Kidney neoplasms Carcinoma Genes▲ 自杀基因（suicide gene）疗法，又称药物敏感基因疗法，是生物治疗的主要方法之一。其采用转基因方法将哺乳类动物中不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内，由于该基因表达产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物，影响细胞的DNA合成，从而引起细胞死亡，达到清除肿瘤细胞的目的；由于此方法经常以病毒作为载体，又称为病毒介导的酶解药物前体治疗（VDEPT）［1］。其中，单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因是应用最为广泛、进展最快、且很有前途、典型的VDEPT系统［2］。我们采用基因工程技术合成带HSV1-TK基因的逆转录病毒载体G1Na-TK，成功转染人肾癌GRC-1细胞并获得表达，其克隆细胞GRC-1/TK对无环鸟苷（ACV）敏感。报告如下。 材料与方法 一、 带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体G1Na-TK的构建 1.重组体G1Na-TK的构建 质粒LNTK含I型HSV-TK全基因及磷酸甘油酸激酶（pgk）基因启动子。逆转录病毒载体G1Na含新霉素抗性基因和BamHI、HindⅢ等单克隆位点。用BamHI和HindⅢ双酶切LNTK，低熔点琼脂糖回收目的基因片断pgk-tk，约2.8kb；用BamHI和HindⅢ双酶切G1Na，用T4连接酶与目的基因片断连接，组成重组体G1Na-TK。 2.重组体G1Na-TK的鉴定：酶切鉴定采用HindⅢ酶切G1Na-TK，酶切抽提产物在1.2％低溶点琼脂糖凝胶上电泳，紫外线灯下观察。PCR鉴定 设计引物TK1：5′CTACACCACACAACACCGCCTC 3′ TK2：5′TCGCAGCCAGCATAGCCAGGTC 3′，经微机检验符合要求，可特异扩增404bp的HSV1-TK基因片断。将重组体质粒加入50μl TE(含Rnase 20μg/ml)中，37℃作用30min，取1μl按PCR体系进行PCR扩增。取扩增产物15μl加溴酚蓝2μl，混匀后于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外线灯下观察。 二、 GRC-1细胞的转染及筛选 参照Lipofectin Reagent药盒说明进行。实验前1h配制A、B两液，室温下放置30～45min后轻混，室温下放置10～15min。取处于对数生长期的GRC-1细胞1×106个，加入AB混合液200μl＋1.8ml无血清、无抗生素的RPMI1640培养液混匀铺于细胞上，于37℃、5％CO2中培养20h；再加入4ml含10％小牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5％CO2中培养48h。转染后加入1 000μg/ml的新霉素筛选。3周后挑选抗新霉素的癌细胞克隆继续培养，称为GRC-1/TK细胞。采用PBS、G1Na空载体分别替代G1Na-TK作对照。 三、GRC-1/TK细胞的鉴定 1.DNA水平鉴定参照DIG标记检测试剂盒（德国BM公司）说明进行。提取GRC-1/TK细胞及PBS或G1Na空载体对照组的DNA，分别用地高辛标记的G1Na-TK基因cDNA探针进行打点杂交及进行PCR扩增。 2.mRNA水平鉴定(mRNA打点杂交)参照DIG标记检测试剂盒说明进行。提取GRC-1/TK细胞及PBS或G1Na空载体对照组的总RNA，用地高辛标记的G1Na-TK基因cDNA探针进行打点杂交。 3.蛋白水平的鉴定(ACV对GRC-1/TK细胞的体外杀伤作用)：肾癌GRC-1细胞和转染TK基因的GRC-1/TK细胞培养，分别加入60μg/ml的ACV（武汉梅山生物化学制药厂），观察细胞生长情况。 结 果 一、 逆转录病毒表达载体重组体G1Na-TK的构建 重组体G1Na-TK经HindⅢ酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下见有两条带，一条为2.8kb，另一条为5.5kb（图1）；PCR扩增后，其扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下见一约404bp大小的扩增带（图2），表明HSV1-TK基因插入正确。 图1 逆转录病毒重组体的酶切鉴定 1.G1Na BamHI、HindⅢ；2.LNTK BamHI、HindⅢ； 3.G1Na-TK BamHI、HindⅢ；4.λDNA/HindⅢ标样 图2 HSV1-TK基因的PCR鉴定 1.G1Na-TK；2.PBS替代组细胞DNA；3.G1Na替代组细胞DNA；4.GRC-1 /TK细胞DNA；5.PBR322 /Hinf I标样 二、 转染HSV1-TK基因的GRC-1/TK的鉴定 1.DNA 打点杂交及PCR扩增结果：仅见GRC-1/TK细胞组及G1Na空载体对照组出现杂交斑点，而PBS对照组未出现杂交斑点；GRC-1/TK细胞可扩增出一约404bp大小的产物，与预期结果相同；而PBS或G1Na空载体对照组均未扩增出产物（图2）。证实GRC-1/TK细胞整合了HSV1-TK基因。 2.mRNA打点杂交结果：见GRC-1/TK细胞组出现杂交斑点，而PBS或G1Na空载体对照组均未出现杂交斑点。证实GRC-1/TK细胞表达HSV1-TK基因的mRNA。 3.ACV对GRC-1/TK细胞的杀伤作用：GRC-1/TK细胞在加入ACV 20h后，开始出现细胞肿胀，变圆脱落，死亡；24～96h后细胞大量死亡；96～110h后，细胞全部死亡，无贴壁细胞生长。GRC-1细胞在同等剂量的ACV作用下，贴壁生长良好，未见细胞死亡。表明GRC-1/TK细胞表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），并获得对ACV的敏感性。 讨 论 肿瘤基因治疗正在快速发展，已有多种治疗方案获准临床应用。目前，肿瘤基因治疗研究主要集中在三个方面：免疫相关基因治疗，药物敏感基因治疗和抑癌基因治疗［3］。对药物敏感基因治疗的研究主要集中在探讨采用TK/GCV治疗各种肿瘤的可能性方面。Moolten［4］于1986年首先将HSV-TK基因转入肿瘤细胞中，目前已有近40种临床试验，其中在脑肿瘤、消化系统肿瘤及卵巢肿瘤中的应用报告较多，已取得良好效果。 来自病毒的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因与来自人类细胞的TK基因所编码的胸腺嘧啶核苷激酶在生化功能上有很大差异。前者主要作用包括：(1)将脱氧胸苷(TdR）磷酸化为一磷酸脱氧胸苷（dTMP）；(2)可将一些特殊的核苷类似物（NAs），如ACV,丙氧鸟苷（GCV）等磷酸化成相应的单磷酸核苷，并进一步磷酸化为三磷酸核苷；而后者仅具有第一方面的作用，核苷类似物与其亲和力很低［5］。三磷酸核苷具有：(1)作为DNA合成链的终止剂，代替dGTP掺入细胞DNA合成链中，(2)作为DNA聚合酶抑制剂，最终干扰分裂细胞的DNA合成，导致分裂细胞的阻抑或死亡［6］。当肿瘤细胞转染HSV-TK基因并有效表达TK时，可获得对核苷类似物的敏感性。当给予核苷类似物（如ACV、GCV），可在TK作用下转变成三磷酸核苷，阻断DNA合成，最终导致肿瘤细胞死亡；而对正常细胞的毒性却很低，从而达到治疗肿瘤的目的。这是采用来自病毒的TK基因治疗肿瘤的机理。 本实验采用基因工程技术成功构建带HSV1-TK全基因的逆转录病毒表达载体G1Na-TK，采用脂质体转染技术将其转染肾癌GRC-1细胞。经DNA打点杂交及PCR检测证实HSV1-TK基因成功整合入肾癌GRC-1细胞中；经RNA打点杂交证实GRC-1/TK细胞表达HSV1-TK基因的mRNA。表明HSV1-TK基因可以转染肾癌GRC-1细胞并获得有效的表达，即可应用于肾癌的自杀基因治疗。与Shirakawa等［7］采用Ad-RSV-TK成功转染肾癌细胞并获得有效表达的结果相似。 整合了HSV1-TK基因的肾癌细胞GRC-1/TK获得了对ACV的敏感性。当给予60μg/ml的ACV治疗时，GRC-1/TK细胞在5天内全部死亡，而对照组GRC-1细胞在同等条件下生长良好。显示ACV可以有效杀伤转染了HSV1-TK基因的肾癌细胞。 有关转染HSV1-TK基因治疗时的“旁观者效应”及转导HSV1-TK基因后肿瘤细胞的死亡过程均在进一步研究中。本实验仅为探讨采用HSV1-TK基因治疗肾癌的可能性而进行初步实验，并为采用自杀基因治疗肾癌提供实验依据。■ 参考文献： ［1］Huber BE, Richards CA, Krenitsky TA . Retroviral-mediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: An innovative approach for cancer therapy. PNAS，1991, 88∶8039-8043. ［2］历周，黄宗海，杨继震. 肿瘤TK基因治疗研究进展. 国外医学肿瘤学分册，1996，23∶271-275. ［3］Paillard F. Cancer gene therapy annual conference 1997：trends and news. Hum Gene Ther, 1998，9∶283-286. ［4］Moolten FL. Chemosensitivity confered by inserted herpes thymidine kinase gene ： paradigm for a prospective cancer control strategy. Cancer Res,1986，46∶5276-5281. ［5］Cheng YC，Dutschman G，Fox JJ，et al. Differential activity of potential antiviral nucleoside analogs on herpes simplex virus-induced and human cellular thymidine kinases. Antimicrob Agents and Chemother,1981，20∶420-423. ［6］Haberkorn U, Altmann A, Morrr I, et al． Multitracer studies du-ring gene therapy of hepatoma cells with herpes simplex virus thymidine kinase and ganciclovir． J Nucl Med, 1997，38∶1048-1054. ［7］Shirakawa T，Gardner TA，Kao CH， et al．Ablative gene therapy treatment of human renal cell carcinoma： cytosine deaminase plus 5-fluorocytosine has superior bystander effect than thymidine kinase plus acyclovir．J Urol，1998，159∶147. 收稿日期：1999-06-11 编辑： 我要评论 复制地址 呆狐社区 加入收藏 打印 关闭
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图1 逆转录病毒重组体的酶切鉴定 1.G1Na BamHI、HindⅢ；2.LNTK BamHI、HindⅢ； 3.G1Na-TK BamHI、HindⅢ；4.λDNA/HindⅢ标样 
图2 HSV1-TK基因的PCR鉴定 1.G1Na-TK；2.PBS替代组细胞DNA；3.G1Na替代组细胞DNA；4.GRC-1 /TK细胞DNA；5.PBR322 /Hinf I标样 二、 转染HSV1-TK基因的GRC-1/TK的鉴定 1.DNA 打点杂交及PCR扩增结果：仅见GRC-1/TK细胞组及G1Na空载体对照组出现杂交斑点，而PBS对照组未出现杂交斑点；GRC-1/TK细胞可扩增出一约404bp大小的产物，与预期结果相同；而PBS或G1Na空载体对照组均未扩增出产物（图2）。证实GRC-1/TK细胞整合了HSV1-TK基因。 2.mRNA打点杂交结果：见GRC-1/TK细胞组出现杂交斑点，而PBS或G1Na空载体对照组均未出现杂交斑点。证实GRC-1/TK细胞表达HSV1-TK基因的mRNA。 3.ACV对GRC-1/TK细胞的杀伤作用：GRC-1/TK细胞在加入ACV 20h后，开始出现细胞肿胀，变圆脱落，死亡；24～96h后细胞大量死亡；96～110h后，细胞全部死亡，无贴壁细胞生长。GRC-1细胞在同等剂量的ACV作用下，贴壁生长良好，未见细胞死亡。表明GRC-1/TK细胞表达
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