缺氧诱导因子－1α在胶原诱导性关节炎大鼠滑膜中的表达和意义

戴辰程¹，戴冽¹ ，郑东辉¹ ，李海刚² ，刘海俊¹

(中山大学附属第二医院 1.风湿免疫科，2.病理科，广东，广州 510120)

[摘 要]  目的：探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在类风湿关节炎(RA)发病中的作用。方法：采用雄性Wistar大鼠建立II型胶原诱导性关节炎(CIA)模型，动态观察CIA大鼠关节炎活动指标，并于造模第21、28、35d取膝关节滑膜分别行HE染色及HIF-1α免疫组化染色，分析HIF-1α蛋白表达与CIA大鼠关节炎活动指标、滑膜病理学评分之间的关系。结果：CIA大鼠膝关节滑膜衬里层和衬里下层细胞胞浆和胞核均表达HIF-1α，且其表达随发病时间延长而逐渐增加；滑膜表达HIF-1α与CIA大鼠关节炎活动指标、滑膜病理学总评分、滑膜增生评分及血管生成评分呈显著正相关，与炎症浸润评分无明显相关。结论：HIF-1α可能通过促进滑膜增生及血管生成而参与RA发病。

[关键词]  胶原诱导性关节炎；缺氧诱导因子－1α；滑膜

[中图分类号]  R593.22       [文献标识码]  A         [文章编号]

Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1α

on synovium from collagen-induced arthritis

DAI Chen-cheng¹, DAI Lie¹, ZHENG Dong-hui¹, LI Hai-gang ², LIU Hai-jun¹

(¹ Division of Rheumatology and Immunology, ²Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510120, China) 

[ABSRACT]  AIM: To investigate the role of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α) in the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA).METHODS: The collagen-induced arthritis （CIA）model was set up in male Wistar rats. The arthritis activity, pathological changes and expression of HIF-1α on synovium at different time were observed through H&E and immunohistochemistry staining. The correlations of HIF-1α expression with the CIA arthritis activity indexes and pathological scores were analyzed. RESULTS: Cytoplasmic and nucleic HIF-1αexpession were

收稿日期：

通讯作者：戴冽，E-mail: dailie2002@21cn.com

found on both lining and sublining area of synovium. HIF-1α expression in synovium increased gradually with the prolonged disease course. Synovial HIF-1α expression correlated significantly with arthritis activity indexes, total pathological score, synovial hyperplasia score and angiogenesis score, but not with inflammation score. CONCLUSION: HIF-1αmay play important roles in the pathogenesis of RA through inducing synovial hyperplasia and angiogenesis.

[KEY WORDS]  collagen-induced arthritis; hypoxia-inducible factor-1α; synovium

缺氧诱导因子－1（hypoxia-inducible factor, HIF－1）是一种调节细胞氧平衡和缺氧反应基因表达的核转录因子，其表达主要受氧浓度调节，活性主要由HIF-1α决定，它能调节血管生成相关基因、血管舒缩基因、凋亡及增殖相关基因、糖酵解酶类及促红细胞生成素等基因表达^[1]。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)关节腔为缺氧环境^[2]，RA滑膜表达HIF-1α明显高于正常滑膜^[3，4]，但HIF-1α在RA发病中的作用及其具体机制未见报道。为此我们通过建立II型胶原诱导性关节炎(CIA)动物模型，动态观察HIF-1α蛋白表达与CIA大鼠关节炎活动指标及滑膜病理学改变之间的关系，以探讨HIF-1α在RA发病中的作用。

材料和方法

1 试剂

牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂购自美国Chondrex公司；HIF-1α单克隆抗体购自美国Chemicon公司；二抗试剂盒(包括正常山羊封闭血清，生物素化二抗，过氧化物酶结合物以及DAB A,B,C试剂各1支)购自美国Zymed公司。

2 实验动物及分组

40只雄性Wistar大鼠，随机分为A、B、C、D组，每组10只，其中A组为正常对照组，B、C、D组为CIA造模组。每组大鼠按照随机的方式进行1～10编号。

3 大鼠CIA模型的建立及滑膜染色

牛Ⅱ型胶原蛋白溶于0.05M冰乙酸中，浓度为2mg/ml，4℃过夜后与等量弗氏不完全佐剂混匀，于冰浴中充分乳化。造模组每只大鼠于距尾根部2cm处皮下注射0.2mlⅡ型胶原乳剂。正常对照组大鼠于距尾根部2cm处皮下注射0.2ml生理盐水。造模组B、C、D组大鼠分别于注射Ⅱ型胶原后第21、28、35d处死，正常对照组大鼠于注射生理盐水后第35d处死，切取双侧膝关节的滑膜组织，用10％中性甲醛固定24h后，石蜡包埋，连续切片分别行HE染色及SP法免疫组织化学染色检测HIF-1α蛋白表达^[3,5]。

4 观察指标

4.1 足肿胀程度：用排水法测量大鼠双足踝关节以下的体积，每日相同时间测量1次。

4.2关节炎指数(arthritis index, AI) ^[5,6]：根据大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度和受影响关节数进行评分。0分：正常；1分：1个关节的红肿；2分：2个及2个以上关节的红肿；3分：波及全足的严重红肿；4分：严重红肿且不能负重。四肢分别进行评分，累计总和即为AI。

4.3滑膜病理学评分^[7]：包括滑膜衬里层增生、衬里下层炎症程度及血管生成情况。衬里层增生评分：少于3层为0分，3～4层为1分，5～6层为2分，6层以上为3分。炎症程度评分：无炎症细胞浸润为0分，炎症细胞散在分布为1分，弥漫分布为2分，形成淋巴滤泡或生发中心为3分。血管生成评分：无新生血管生成为0分，轻度新生血管生成为1分，中度为2分，重度为3分。以上3项评分累计总和即为病理学总评分。

4.4免疫组织化学染色结果判定及评分： HIF-1α阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色。根据阳性细胞的比率和染色强度进行半定量评分^[8]。先按阳性细胞比例将无、1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％分别计为0～4分；再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0～3分，最后将两部分得分相乘。滑膜衬里层、滑膜衬里下层分别进行评分。衬里层和衬里下层评分相加为滑膜总评分。

5 统计学处理

所有数据处理均采用SPSS 10.0统计软件包进行。正态分布资料以均数±标准差表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析；半定量资料两组间比较采用Mann-Whitney秩和检验；对两组数据间的相关性进行Spearman等级相关分析。

 结   果

1 大鼠CIA模型的建立  造模组30只大鼠中有4只于注射Ⅱ型胶原后尚未发病时死亡，其余26只中有17只（其中B组5只，C组和D组各6只）在造模第11～17d发生踝、跖趾关节以及趾关节红肿。正常对照组均未出现关节红肿。造模成功率为65.4％（17/26）。

2 CIA大鼠足肿胀程度及AI的变化  CIA大鼠于造模第11d开始出现关节红肿，第23d足肿胀程度及AI达最高，然后逐渐下降。CIA大鼠从造模第14d开始其足肿胀程度及AI均明显高于正常对照组（P<0.05）。

3 CIA大鼠病理学改变及评分  正常对照组大鼠滑膜衬里层由1～2层扁平上皮样滑膜细胞组成，衬里下层由脂肪细胞和散在血管组成，其各项病理学评分均为0。CIA大鼠滑膜增生，衬里层细胞层数增多，衬里下层有大量炎症细胞浸润，新生血管数目也明显多于正常滑膜，具体病理学评分见表1。

                      表1  CIA大鼠滑膜病理学评分

Tab 1  Pathological scores of CIA synovium （ ±s）

    Group     Total      Hyperplasia   Inflammation   Angiogenesis             

 B(n=5)   2.60±0.55     1.2±0.41    1.00±0.70     0.4±0.55     

 C(n=6)   3.33±1.17^*    1.33±0.84    1.33±0.52    0.67±0.52      

 D(n=6)   5.33±0.82^△    1.67±0.82    1.67±0.41    2.50±0.55^＃      

^* P<0.05 vs group B；^△P<0.01 vs group C；^＃P<0.05 vs group C.

4  CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白的表达  正常对照组滑膜衬里层和衬里下层均未见HIF-1α阳性细胞。CIA大鼠造模第21d滑膜衬里层部分细胞胞浆呈HIF-1α阳性，第28d衬里下层部分细胞胞浆呈HIF-1α阳性，第35d衬里层和衬里下层HIF-1α阳性细胞明显增加（见表2），且部分细胞的胞核也呈HIF-1α阳性。

表2  CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表达的免疫组化评分

Tab 2  Immunohistochemical scores of HIF-1α protein expression in CIA synovium（ ±s）

Group          Lining layer       Sublining layer              

 B(n=5)          0.20±0.45              0             

 C(n=6)          1.33±1.63          0.67±1.03    

 D(n=6)          7.83±4.36^△         1.50±1.64^△   

     ^△P<0.05 vs group C.

5  CIA大鼠滑膜HIF-1α表达与大体关节炎活动指标的关系  CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表达的免疫组化评分与关节炎活动指标足肿胀程度、AI呈明显正相关,相关系数(r)分别为0.63和0.67，P<0.05。

6  CIA大鼠滑膜HIF-1α表达与病理学评分的关系  CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表达的免疫组化评分与滑膜病理学总评分、滑膜增生评分及血管生成评分均呈明显正相关，r分别为0.73、0.39及0.42，P<0.05，与炎症浸润评分无明显相关, r为0.21，P>0.05。

 讨   论

CIA是研究RA最常用的动物模型。本研究结果表明，CIA大鼠滑膜表达HIF-1α蛋白，随发病时间延长而逐渐增加，而且在胞浆表达的同时又渐出现胞核表达，提示HIF-1α在CIA大鼠关节病变过程中呈动态表达并具有核转录因子活性。CIA大鼠滑膜表达HIF-1α与关节腔内低氧环境促使HIF-1α蛋白表达增加及降解减少有关，同时关节炎滑膜中IL-1和TNF-α可进一步促进HIF-1α表达^[2]。HIF-1α只有从胞浆转移至胞核并与HIF-1β结合成完整的HIF-1分子，才能与细胞核中HIF-1靶基因的缺氧反应元件结合，促进靶基因转录，从而发挥核转录因子活性^[9]。

本研究还发现，CIA大鼠滑膜HIF-1α表达与大体关节炎活动指标及滑膜病理学总评分呈明显正相关，提示滑膜HIF-1α表达与CIA大鼠关节炎病变密切相关。RA患者关节腔滑液中氧分压和疾病严重程度（滑膜病理学评分）呈负相关^[2]，低氧可通过促进HIF-1α表达而参与CIA及RA关节炎发病。

RA关节破坏的病理学基础是滑膜炎。RA滑膜炎时，新生血管大量形成和滑膜不断增生逐渐形成具有侵袭性的血管翳，破坏关节软骨、软骨下骨和关节周围软组织。血管生成是RA关节破坏发生发展的重要环节之一。体内外实验均已证实，减少血管生成能有效减轻RA病情^[10]。本研究显示，CIA大鼠滑膜血管生成随发病时间延长而明显增加，且其评分与滑膜HIF-1α蛋白表达呈显著正相关，提示HIF-1α与CIA大鼠滑膜血管生成密切相关。血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成最重要的因子，其表达主要受HIF-1α调控。HIF-1α通过上调VEGF表达而促进血管生成，可能是其参与RA发病最重要的机制之一^[2，11]。本研究还发现，CIA大鼠滑膜HIF-1α表达与滑膜增生评分呈明显正相关，提示HIF-1α可能在CIA及RA滑膜增生中也发挥作用，而滑膜增生又可加剧滑膜组织尤其是滑膜衬里层缺氧状态，进一步促进HIF-1α表达及滑膜增生。

CIA及RA滑膜衬里下层有大量炎症细胞浸润。缺氧状态下，HIF-1可通过诱导粘附分子如β2整合素^[12]、趋化因子如基质细胞来源因子及其受体CXCR4基因表达^[13]，促进单核细胞、T细胞和B 细胞聚集在RA滑膜。本研究显示，CIA大鼠造模第28d始滑膜衬里下层炎症细胞表达HIF-1α，但与炎症浸润程度无明显关联。有关滑膜炎症细胞表达HIF-1α及其与CIA/RA滑膜炎症反应之间的关系，有待进一步研究。

综上所述，本研究结果显示CIA大鼠关节滑膜表达HIF-1α，并与关节炎病情活动、滑膜增生及血管生成密切相关，提示HIF-1α可能在CIA/RA关节病变中起重要作用。

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（发表在《中国病理生理学杂志》2007年第8期1606-1608页）