B细胞清除疗法治疗类风湿关节炎

            曾燕  戴冽

类风湿关节炎(RA)是一种系统性的自身免疫性疾病，以受累关节的慢性滑膜炎症为基本病变，患者因慢性疼痛和疲劳失去日常生活能力，并且多数患者伴有软骨和骨的破坏，由此可导致终身残疾。虽然RA确切的发病机制还不清楚，但普遍认为可能是由外源性或内源性的抗原对具有某些遗传易感背景的人触发一系列在滑膜中的自身免疫反应。多个细胞亚群包括单核细胞、巨噬细胞、Ｂ细胞、Ｔ细胞、内皮细胞和成纤维细胞，参与这一炎症过程。近年来针对T细胞、单核细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的生物制剂治疗RA发展迅速^［1］，在过去的15年中，治疗RA最大的进展是抗肿瘤坏死因子（TNF-α）抗体的应用。目前认为滑膜中的巨噬细胞是TNF-α的主要来源，但促使滑膜巨噬细胞产生TNF-α的因素尚未明确，一种假说认为可能是由巨噬细胞摄取免疫复合物引起，如果这一假设成立，那么产生类风湿因子（RF）抗体的B 细胞将可能成为治疗RA的目靶。最近的一项多中心随机双盲对照研究证实了B细胞清除疗法在活动性RA患者中的疗效和安全性，同时也进一步揭示了B细胞在RA发病机制中的重要作用^［2］。

一、Ｂ细胞清除疗法治疗RA的机理

（一）Ｂ细胞在RA发病机制中的作用

Ｂ细胞在RA发病机制中的具体作用还不清楚，现在认为Ｂ细胞可能通过以下多个途径发挥作用：①Ｂ细胞作为抗原呈递细胞，向CD₄⁺T细胞提供重要的协同刺激信号，使T细胞分泌多种细胞因子发挥作用；②Ｂ细胞在RA关节滑膜中分泌产生多种炎症介质包括TNFα等细胞因子促进炎症反应；③RA滑膜中含有丰富的Ｂ细胞可以产生RF抗体。RF阳性的患者关节侵袭破坏更明显，更常见伴有关节外病变，而且患病率和死亡率都明显增加。RF尤其是IgG型RF可形成免疫复合物激活Ｂ细胞向Ｔh细胞呈递抗原，激活补体，从而引起关节局部或其他部位的病变，并产生持续增高的RF^[3]；④T细胞被认为在RA的发病中起主导作用，而最近的研究表明T细胞的激活和作用是依赖于B细胞的^[4]。

（二）B细胞清除疗法的机理

过去证实B细胞清除假说存在这样一个问题，那就是传统的影响B细胞的药物包括类固醇激素、环磷酰胺(CTX)等缺乏特异性。利妥昔（Rituximab）作为特异性的抗B细胞制剂，它的出现为证实B细胞清除疗法的疗效提供了可能。

利妥昔是利用重组DNA技术将鼠抗CD20单克隆抗体的可变区Fab与人免疫球蛋白(IgG₁)抗体恒定区Fc片段结合的鼠／人嵌合抗体，可在中华仓鼠卵巢细胞中大量产生。它含1328个氨基酸，分子量约144kd。鼠源性的Fab可变区与CD20抗原有高度的亲和力，人IgG₁Fc片段替代鼠Fc片段后不仅半衰期延长，而且可降低诱导人抗鼠抗体的产生，从而避免其被中和失效。另外，人IgG₁Fc片段与人体内各种效应细胞的结合能力较鼠Fc片段强1000倍，因此能更有效地介导人效应细胞发挥作用。CD20抗原是一种细胞表面非糖基化疏水磷酸蛋白，其分子量为35000kd。目前研究发现CD20抗原是信号传递通道复合物的一部分，其功能类似于钙离子通道，参与调节B细胞的生长和分化。CD20抗原严格限制在所有的前B细胞的晚期和成熟B细胞表面表达，在造血干细胞、祖细胞和其他正常组织中没有表达，当B细胞分化为分泌抗体的浆细胞时，CD20抗原的表达也随之消失。CD20抗原与抗体结合后，不发生调变(modulate)、不会从细胞表面脱落或与配体结合后被内化(internalize)，而且目前尚未发现细胞膜上或分泌型的分子会干扰CD20抗原的功能，并且循环中也未发现游离的CD20抗原，因此CD20抗原是免疫清除B细胞的理想作用位点。

利妥昔作为第一个被证明安全有效的单克隆抗体，与Ｂ细胞表面的CD20抗原结合，可能通过以下多种机制杀灭Ｂ细胞：①其Fc片段与各种效应细胞（巨噬细胞、NK细胞、单核细胞、T细胞等）的Fc受体结合，激活效应细胞释放具有细胞毒性的穿孔素和颗粒酶，介导抗体依赖的细胞毒途径促使B细胞溶解；②流式细胞仪检测发现利妥昔能与补体的C1q结合，使补体蛋白固定在抗体包被的B细胞表面，介导补体依赖的细胞毒途径杀灭B细胞^［5］；③ 利妥昔亦可直接诱导B细胞凋亡^［6］，但这一机制的发生需要抗体之间广泛交联，因为广泛交联增加了抗体识别抗原信号的活性。含Fc受体的效应细胞在抗体交联过程中发挥了重要的作用，中和Fc受体可完全抑制利妥昔诱导凋亡的作用^［7］。

B细胞清除疗法除利妥昔外，还有其他单抗产品如抗CD-22和BLyS/BAFF拮抗剂正在被研究开发，这些产品的研究没有利妥昔深入和广泛，但相信会得到越来越多的关注。

（三）利妥昔治疗RA的机理

通过利妥昔单抗清除B细胞成功地治疗RA揭示了B细胞在滑膜炎症中的重要作用，目前认为主要有以下两种假说解释利妥昔治疗RA的机理：①Edwards等^[2]提出，利妥昔可能通过清除记忆B细胞（其能转化为分泌抗体的浆细胞）而减少TNFα细胞因子的产生；②Takemura S^［4］通过将人的滑膜组织移植到联合免疫缺陷小鼠，发现通过利妥昔清除B细胞后迅速地减少了γ-干扰素（与TNF-α一样来源于T细胞）的生成，提示利妥昔可能通过清除作为抗原呈递细胞的B细胞从而减少T细胞的活化及依赖T细胞的滑膜炎症反应。

二、利妥昔治疗RA的临床应用

利妥昔最早用于常规治疗无效或复发的CD20⁺B细胞非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma,NHL)。1999年Protheroe^［8］报导的合并RA的NHL患者使用利妥昔治疗后RA的病情也得到缓解，提示利妥昔在RA临床应用的可能。

2001年Edwards和Cambridge^[9]报导的5例难治性RA的开放性研究结果首次证明了利妥昔在RA中的应用潜质，这5例RA患者入选前至少使用过五种改变病情抗风湿药（DMARDs）而病情未得到控制。试验中给予利妥昔（300mg第２天，600mg第8、15、22　天静脉注射）、CTX（750mg第4、17天静脉注射）和口服泼尼松（30～60mg/天，持续22天）的联合治疗方案，观察76周。结果26周时5例患者均达到ACR(American College of Rheumatology)50%疗效标准，其中3例达到ACR70%疗效标准，疗效持续至26周以后，疗效持续时间如此长出乎人们意料，因为在治疗中仅短暂使用泼尼松和CTX，B细胞即被清除到无法检测的水平。试验中未发生严重的不良反应，免疫球蛋白维持在正常范围。该项研究结果尚不能令人信服，但随后的多个报导同样也证明了B细胞清除疗法在RA中的疗效，如2002年De Vita S^[10]报导了5例伴关节侵袭破坏的活动期RA患者，既往甲氨蝶呤（MTX）、环孢素A和抗TNF-α抗体（infliximab）治疗无效，用利妥昔治疗2个月后2例患者病情明显好转，其中1例达ACR70%疗效标准，维持至10个月后复发，1例达ACR50%疗效标准，12个月后复发；2例达ACR20%疗效标准并分别维持至5个月和7个月；1例对治疗无反应。2005年Higashida J^[12]也报导了17例抗TNF-α抗体或其他传统抗风湿药治疗无效的RA患者接受利妥昔治疗4周（每周注射一次）后，第5、8、16、28周达到ACR50%疗效标准的患者分别为36%、25%、42%和33%，达到ACR70%疗效标准的患者分别为18%、17%、25%和17%，均未出现明显的副作用。另外，Leandro^[11]观察了不同剂量利妥昔的疗效，结果发现利妥昔总量≥600mg/m² 时联用CTX和激素疗效明显。

然而，更有意义的是2004年Edwards等^[2]报导的一项多中心随机双盲对照试验，结果进一步证明了利妥昔在活动性RA患者中的疗效和安全性。161例活动期的难治性RA患者随机分为四组：①口服MTX≥10mg/周＋安慰剂作为对照组；②利妥昔＋安慰剂组；③利妥昔＋CTX(750mg第3和17天静脉注射)＋安慰剂组；④利妥昔＋MTX＋安慰剂组。所有利妥昔治疗组分别在第1和15天静脉注射1000mg。所有治疗组均接受类固醇激素治疗，其中在注射利妥昔（或者利妥昔安慰剂）或者CTX（或者CTX安慰剂）时静脉注射100mg甲基泼尼松龙，在第2和第4~7天口服泼尼松60mg，在第8~14天口服泼尼松30mg。24周后达到ACR50%疗效标准的患者利妥昔＋MTX组为43%(P=0.005)，利妥昔＋CTX组41%(P=0.005)，利妥昔单独治疗组33%(P=0.059)，而对照组为13%。48周达到ACR50%疗效标准利妥昔＋MTX组为35%(P=0.002)，利妥昔＋CTX组为27%(P=0.01), 利妥昔单独治疗组15%与对照组5%相比无明显统计学差异。在24和48周达到ACR70%疗效标准的患者中利妥昔＋MTX组与对照组相比明显增加(P=0.048和0.03)，其余两组利妥昔治疗组与对照组相比ACR70%疗效标准有增加，但无明显统计学差异。总的来讲，利妥昔单独使用或者和其他药物联合使用疗效明显优于MTX单独治疗组，并且利妥昔＋MTX组和利妥昔＋CTX组相比疗效接近，甚至还优于后者。

上述研究均采用利妥昔联合CTX和类固醇激素的治疗方案，所有患者均接受了短期激素治疗。然而，类固醇激素被公认对RA具有很强的抗炎作用，并且可能促进B细胞凋亡或影响其细胞周期^［9-11］，因此利妥昔清除B细胞疗法治疗RA是否需要联合使用类固醇激素仍需要进一步的研究。

三、展望

 利妥昔成功治疗RA的报导揭示了一种新的RA治疗方法－—B细胞清除疗法。与抗TNF-α抗体治疗RA停药后病情容易反跳不同的是，短期利妥昔治疗即能获得持久的临床疗效，最长可达42个月，提示B细胞清除疗法治疗RA可能达到长期缓解的目标^［13］。另外，有研究^［14］发现B细胞清除疗法还可用于RA以外的其他自身免疫性疾病，提示B细胞清除疗法可能有巨大的潜在临床应用价值。

然而，截止目前利妥昔治疗RA的例数尚少，缺乏长时间使用或反复使用的临床观察数据，并且也没有关于评价利妥昔治疗RA影像学进展的报导。也许只有证明利妥昔能抑制骨的破坏和减少软骨的丢失，才能广泛地应用到临床。另外，研究中发现部分患者对利妥昔治疗反应好，能达到ACR50%甚至ACR70%疗效标准，而另一些患者的疗效不明显甚至无效，因此今后在临床使用的过程中如何选择合适的患者也是需要解决的问题。

参考文献

1  Shanahan JC, Moreland LW, Carter RH. Upcoming biologic agents for the treatment of rheumatic diseases. Curr Opin Rheumatol, 2003,15: 226-236.

2  Edwards JC, Szczepanski L, Szechinski J, et al. Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis. N Engl J Med, 2004, 350:2572-2581.

3  Kim HJ, Berek C. B cells in rheumatoid arthritis. Arthritis Res, 2000,2:126-131.

4 Takemura S, Klimiuk PA,Braun A, et al. T cell activation in rheumatoid synovium is B cell dependent. J Immunol, 2001,167:4710-4718.

5  Cragg MS, Morgan SM, Chan HT, et al. Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts. Blood, 2003,101:1045–1052.

6  Deans JP, Li H, Polyak MJ. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid

rafts. Immunology, 2002,107:176–182.

7  Mathas S, Rickers A, Bommert K, et al. Anti-CD20- and B-cell receptor-mediated apoptosis: evidence for shared intracellular signaling pathways. Cancer Res, 2000, 60:7170-176.

8  Protheroe A, Edwards JC, Simmons A. Remission of inflammatory arthropathy in association with anti-CD20 therapy for non-Hodgkin’s lymphoma. Rheumatology (Oxford), 1999,38: 1150-1152.                         

9  Edwards JC, Cambridge G. Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to delete B lymphocytes. Rheumatology (Oxford), 2001, 40:205-211.

10  De vita S, Zaja F,Sacco S, et al. Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis: evidence for a pathogenetic role of B cells. Arthritis Rheum, 2002, 46: 2029-2033.

11 Leandro MJ, Edwards JC, Cambridge G. Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion. Ann Rheum Dis, 2002,61:883-888.

12  Higashida J, Wun T, Schmidt S, et al．Safety and efficacy of rituximab in patients with rheumatoid arthritis refractory to disease modifying antirheumatic drugs and anti-tumor necrosis factor- treatment．J Rheumatol, 2005, 32:2109-2115.

13  Edwards JC, Leandro MJ,Cambridge G. B lymphocyte depletion therapy with rituximab in rheumatoid arthritis．Rheum Dis Clin North Am, 2004, 30:393-403.

14  Edwards JC, Cambridge G. Prospects for B-cell-targeted therapy in autoimmune disease. Rheumatology (Oxford), 2005,44:151–156.

(发表在《国际内科学杂志》2007年第9期552-555页)