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皮肤病理制片技术的改进
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皮肤病理制片技术的改进
宜昌市怡康医院 张东赟 徐莉莉
皮肤病理学检查对皮肤科临床诊断、疾病鉴别诊断、预后判断有重要意义，对于某些皮肤病的诊断更是具有决定性的作用。而一张高质量的病理切片对于皮肤病理诊断起着决定性的作用。因皮肤组织的多层次、密度不一、纤维含量丰富的特点，其病理制片的操作流程与普通病理制片有着很大的不同。我科从2001年开始开展皮肤病理业务，按照普通病理制片的手工操作流程，不断改进。通过四年来800多例皮肤病理的制备，我们获得了较为成熟的皮肤病理制片技术，现将其介绍如下:
一、试剂配制:
10%甲醛,各种浓度的乙醇,二甲苯,正丁醇,苏木素染液,伊红染液,1%盐酸-乙醇,中性树胶。
二、皮肤病理制片与普通病理制片的手工操作流程比较:
皮肤病理制片
普通病理制片[1]
固定
10%甲醛
10%甲醛等固定液
水洗
20min
30min
脱水
60℃恒温80%乙醇(20~30min) →95%乙醇Ⅰ(45~60min) →95%乙醇Ⅱ(45~60min) →无水乙醇(20~30min)
常温80%乙醇(60~120min)→95%乙醇Ⅰ(60~120min) →95%乙醇Ⅱ(60~120min) →无水乙醇Ⅰ(30~60min) →无水乙醇Ⅱ(30~60min) →无水乙醇Ⅲ(30~60min)
透明
60℃恒温.正丁醇(20~25min)
常温.二甲苯Ⅰ(20min)→二甲苯Ⅱ(20min)→二甲苯Ⅲ(20min)
浸蜡
石蜡Ⅰ(54~56℃.45~60min)→石蜡Ⅱ(56~58℃. 45~60min)
石蜡Ⅰ(45~50℃.60min) →石蜡Ⅱ(56~58℃. 60min) → 石蜡Ⅲ(56~58℃. 60min)
包埋
垂直包埋
切片
先切皮下组织,最后是角质层
烤片
30min~60min
30~60min
HE染色
二甲苯Ⅰ(5~8min) →二甲苯Ⅱ(5~8min) →无水乙醇Ⅰ(1min) →无水乙醇Ⅱ(1min) →95%乙醇(1min) →80%乙醇(1min) →70%乙醇(1min) →苏木素染色(10～20min) →流水冲洗(1min) → 1%盐酸－乙醇(5s) →流水冲洗(20～30min)→0.5%伊红液染色(3～5min) →95%乙醇Ⅰ(1min) →无水乙醇Ⅰ(1min) →无水乙醇Ⅱ(1min)
二甲苯Ⅰ(5~10min)→二甲苯Ⅱ(5~10min)→无水乙醇Ⅰ(1~3min) →无水乙醇Ⅱ(1~3min) →95%乙醇Ⅰ(1~3min) →95%乙醇Ⅱ(1~3min)
→80%乙醇(1min) →蒸馏水(1min)
→苏木素染色(5～10min) →流水洗去苏木素液（1min）→1%盐酸－乙醇(1～3s) →流水冲洗(10～15min) →蒸馏水洗(1～2min) →0.5%伊红液染色(1～3min) →蒸馏水洗(1～2s) →80%乙醇(1~2s) →95%乙醇Ⅰ(2~3min)→95%乙醇Ⅱ(2~3min) →无水乙醇Ⅰ(3~5min) →无水乙醇Ⅱ(3~5min) →无水乙醇Ⅲ(3~5min) →二甲苯Ⅰ(3~5min)→二甲苯Ⅱ(3~5min)→二甲苯Ⅲ(3~5min)
三、病理制片流程分析:
3.1皮肤组织在取材时,考虑到伤口愈合后的外观,故取材一般较小,大多在1.0cmx0.5cmx0.3cm以内。且皮肤组织含水相对其它组织较，,因而在脱水时，可以缩短脱水时间.普通病理制片手工操作脱水所需时间6~9小时,为缩短脱水时间，我们采用60℃恒温.这样，1个工作日即可报告结果。
3.2因二甲苯可以致癌,我们在制片过程中,采用正丁醇代替二甲苯透明,效果基本相同。
3.3皮肤表皮层细胞核较多，故苏木素染色时间相对较长，1%盐酸-乙醇分化后冲洗的时间也相对延长，这样细胞核显示更清晰，对比度更强。
四、讨论:
病理制片是一个熟能生巧的过程，任何操作都不可能是一成不变的。不同的湿度，不同的温度，所制出来的切片质量就会不一样。如苏木素染液夏季(我单位位于长江中上，,37℃左右)只需10分钟左右，冬季(0℃左右)则需20分钟左右。制片过程中遇到困难,首先应在组织块固定、脱水、透明和浸蜡中寻找原因。
五、经验交流
5.1 皮肤组织不宜与其它病理组织一起制作，脱水用的乙醇因经常更换。
5.2 切片时,如果组织易碎,可能原因为:(1)脱水过度,(2)浸蜡时间不足。
5.3 摊片的水温应控制在45~48℃,过高，蜡和组织易分离；过低，切片无法摊开,易皱褶、折叠。
5.4脂肪组织在制作时,脱水时间需延长,浸蜡时间也需延长,在浸蜡时,还可取出组织,稍加挤压,去掉一些油脂。
5.5切片时,应按皮肤组织的特点,由里至外,最后切角质层。因角质层密度最大,易碎。这样才可摊得比较完整的切片。
5.6在切片过程中,切出来的蜡块易粘附在包埋的石蜡块上,不易得到连续的蜡带，其原因为:(1)刀片上有油,可用纸擦掉；(2)蜡带与刀片之间有静电,可用棉签蘸水擦刀片和蜡块。
5.7染色的过程可用显微镜在镜下控制，但不可使切片干燥。如苏木素染色过深，可延长水洗时间，1%盐酸-乙醇新配制的较好。
改进后制得的切片(HE染色) 普通病理制片方法制得的切片(HE染色)
参考文献:
[1]中华医学会 编著 临床技术操作规范-病理学分册北京 人民军医出版社 2004
[2]杨国亮 王侠生 主编 现代皮肤病学上海 上海医科大学出版社 1996 |
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