中山大学中山医学院病理学教研室 梁英杰

病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，正确的染色结果是病理诊断的重要依据之一。病理技术的规范与否，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生作出正确的病理诊断。因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片质量的控制，为提高临床病理诊断水平，促进临床病理学事业的发展作出我们应有的贡献。

1 ．高素质技术人员的规范管理

1.1  作为技术员要有敬业精神和强烈的工作责任心。努力学习，刻苦钻研，掌握过硬的基本功，引进和学习新技术，工作精益求精。

1.2  科室领导应重视病理技术工作，为技术人员提供进修学习和提高的条件和机会。

1.3  技术员和医生，技术员与技术员应互相团结，密切配合，发挥团队精神的作用。

2 ．仪器设备的规范管理

2.1  科室应配备工作所必须的仪器设备。先进，高质量的仪器设备是保证和提高制片质量的重要条件。

2.2  技术员对仪器设备要正确使用，定期维修保养，保证仪器设备在最佳的状态下工作。

3 ．标本和资料档案的规范管理

3.1 标本和送检单的接收  

病理标本送达后，应立即检查标本和送检单的名字是否相符，有否标本，必要时要补充标本的固定液，然后将送检单编号登记。

3.2  资料档案的规范管理   

诊断报告发出后，附有诊断报告记录的送检单、玻片和组织蜡块马上存档并专人保管。建立严格的资料借出制度，确保档案资料不被丢失。

4 ．技术的操作规范

4.1  组织固定  固定是把病理活体或尸体解剖切取下来的组织泡浸在适宜的化学试剂（一种或多种试剂配成的溶液），而这种化学试剂能使组织或细胞内的蛋白质凝聚、沉淀或变性，使组织细胞内的一些物质成为不溶性，同时使组织细胞原有的形态结构尽可能保持。因此，组织应及时固定，固定不当或固定不及时，都会影响组织的脱水、切片和各种染色。

 固定液的使用和配制：

固定组织所使用由化学试剂配成的溶液称为固定液。固定液常用10％～20％福尔马林液（甲醛稀释液），甲醛易氧化成甲酸而偏酸性，因此可配成中性福尔马林液。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约4小时左右，然后在取材时修切成大小约22×22mm，厚不超过2mm的组织块进行脱水。

取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。

* 常规固定液的配制

（1）10% 福尔马林液

 浓甲醛                            10 ml

 蒸馏水                            90 ml

（2）缓冲中性福尔马林液

浓甲醛                            10 ml

PBS缓冲液（pH7.2）             　 90 ml

（3）10%中性福尔马林液

浓甲醛                            10 ml

蒸馏水                            90 ml

碳酸钙                        　 加至饱和

* 冷冻切片固定液的配制 

（1）乙醚-乙醇液

无水乙醚                            1份

95%乙醇                             1份

（2） 乙醇--冰醋酸液

95%乙醇                          100 ml

冰醋酸                           3～5滴

* 细胞学涂片固定液的配制

（1）乙醇-冰醋酸液

95%乙醇                           97 ml

冰醋酸                             3 ml

（2）乙醚-乙醇-冰醋酸液

乙   醚                           50 ml

95%乙醇                           50 ml

冰醋酸                             1 ml

（3）Carnoy’s液

无水乙醇                          60 ml

氯仿                              30 ml

冰醋酸                            10 ml

固定的目的：

（1）破坏细胞内的溶酶体酶。组织离体后，失去氧的供应，细胞就死亡并释放出溶酶体酶把细胞溶解，称为组织自溶。因此，组织固定的目的首先是立即杀死细胞并将溶酶体酶固定及膜性结构固定，防止细胞的自溶。

（2）杀死外来细菌。离体后的组织即失去活力，如不及时固定，就失去抵抗细菌的能力，在室温下极易使细菌生长繁殖，导致组织的腐败。

（3）尽可能保持生活体的原状。如活细胞时的微细结构，核在有丝分裂时的形态，细胞内含物的装置等。都要求通过固定保持细胞原有状态，以利于进行观察研究。

（4）凝聚、沉定细胞内原有产物，使不被溶解或消失。细胞是由蛋白质、糖类、脂类、各种无机盐和色素等组成，在固定过程中要尽可能保存各种物质为不溶性。

（5）使组织保持一定的硬度和弹性，抵抗以后的脱水、透明、浸蜡等过程不发生较大的扭曲或变形，使各级溶液在组织间隙内自由交换取得良好的制片效果。

（6）对组织的分析性染色起媒染作用。

（7）有利于区别各种细胞的折光率。固定使不同细胞或细胞内各种物质产生不同折光率，染色后利于识别各型细胞的结构。

4.2  组织脱水   组织脱水就是利用某些能与水相混合的化学试剂泡浸组织，把组织内水分逐步置换出来。

脱水的目的：组织经过水溶性固定液固定和水洗后，其间隙内含有较多水分，因水与二甲苯、石蜡是不能混合的，即使组织间隙内含有极少的水也会阻碍二甲苯和石蜡的渗透，所以未经脱水或脱水不彻底的组织不能直接进入二甲苯透明和石蜡中浸蜡。只有使组织内部水分彻底脱除，才能进行透明、浸蜡、包埋组织蜡块才能长久保存。

常用的脱水液为乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般70～100%的浓度），逐步置换组织内的水份，最后组织内部水分被高浓度乙醇所取代。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇（95%以下）的时间可适当延长，高浓度乙醇（100%）脱水时间不能过长。

4.3  组织透明   组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程；才能进行浸蜡。

透明的目的：组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同，一般为30～60分钟。

4.4  组织浸蜡   用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助。根据脱水机配有的蜡缸数量，浸蜡采用二级至四级，以尽量清除二甲苯。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。

4.5  组织包埋   组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约3~5℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋完后，蜡块要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。

4.6  组织切片   组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3～4μ，对一些组织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为2～3μ。要切出薄而平整的切片需要正确使用切片机，切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧切片机上有关的各螺旋，保证切片刀锋利和调至合适的角度。组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。

4.7  贴片烤片   切出的蜡片可先放在约10~15％乙醇内，然后置恒温水中，这样因水的表面张力比乙醇大，蜡片便容易在温水中展平，根据包埋石蜡的熔点不同，水温约为39～42℃左右。贴片时要注意贴在载玻片中间稍偏右的位置上。对一些组织如皮肤、胃肠等贴片时要注意表皮或粘膜面在下，真皮或肌层在上，方便在镜下观察。贴好片后放入约60～65℃的烤箱内或恒温热板上烤烘15~30分钟，使蜡片牢固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石蜡的熔点高5℃左右。

4.8  切片脱蜡   切片在染色前必须脱蜡干净，脱蜡不干净会影响组织细胞的着染，即使着染，组织和细胞也会模糊不清。脱蜡一般用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为10～20分钟。如果脱蜡剂使用多次或室温较低，均需延长脱蜡时间。
4.9 苏木精染液配制   配好苏木精染液是HE染色的关键。苏木精配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木精染液的染色时间为5～20分钟，自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长。

* 苏木精染液的配制方法：

（1）Harri’s苏木精

         苏木精                              1 g

         无水乙醇                          10 ml 

         硫酸铝钾                           20 g

         蒸馏水                           200 ml

         氧化汞                            0.5 g

         冰醋酸                             8 ml

分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。

（2）改良Lillie-Mayer’s苏木精

          苏木精                            2.5 g

          无水乙醇                         20 ml 

          硫酸铝钾                           5 g

          蒸馏水                           330 ml

          碘酸钠                           250 mg

          甘油                             150 ml

冰醋酸                            10 ml

   分别用无水乙醇溶解苏木素，蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。

   （3）Mayer’s苏木精

          苏木精                           100 mg

          蒸馏水                            100 ml

          碘酸钠                            20 mg

          硫酸铝铵                            5 g

柠檬酸                           100 mg

水合氯醛                            5 g

用蒸馏水溶解苏木精后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、柠檬酸和水合氯醛，过滤后存于4℃冰箱备用。

4.10  分化  分化是把过染的细胞核部分和不应着染苏木精的细胞浆等组织成分脱色，从而使着染的细胞核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木精染色的深浅和分化液的新旧来决定，一般是2～5秒钟，若切片不分化或分化不足，组织不仅着染细胞核，也着染细胞浆等其他成分，使组织结构对比不清晰；若分化过度，细胞核过淡或褪色。用Mayer’s苏木精染色，通常都不用分化。盐酸乙醇分化后，一般需流水冲冼，避免切片留有盐酸，使细胞核褪色。另一方面苏木精经酸后要经流水冲洗来促兰。流水冲冼一般需15～30分钟。如要缩短时间，可用碱性的促兰液来代替流水冲洗。

* 盐酸-乙醇分化液的配制

  浓盐酸                                1ml

   70%乙醇                              99ml

* 促蓝液的配制
 （1）Scott促蓝液

重碳酸钠                           0.35 g

硫酸镁                                2g

蒸馏水                             100ml

麝香草酚少量

（2）氢氧化氨水溶液

浓氨水                           0.1～1ml 

蒸馏水                              99ml

（3）碳酸锂水溶液

碳酸锂                                 1 g

蒸馏水                               100ml

4．11  曙红染液配制   曙红主要是染细胞浆和肌纤维、胶原纤维和红细胞等作为对比染色，染色适中与细胞核相衬，红兰对比鲜明。 在曙红水溶液中加冰醋酸可起促染作用， 但加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢失效。

* 曙红液的配制

（1）0.25～0.5%曙红Y水溶液。

曙红Y                          0.25～0.5g

蒸馏水                              100ml

冰醋酸                                1滴

（2）0.5曙红Y—氯化钙水溶液    

          曙红Y                                 0.5g

蒸馏水                               100ml

无水氯化钙                             0.5g

（3）0.25～0.5%曙红Y乙醇溶液。

曙红Y                             0.25～0.5g

80%乙醇                              100ml

*  常规HE染色步骤：

（1）二甲苯（Ⅰ）                           5-10 min

(2) 二甲苯（Ⅱ）                           5-10 min

(3)  95%乙醇（Ⅰ）                          1-3 min

（4）95%乙醇（Ⅱ）                           1-3 min

（5）80%乙醇                                  1 min

（6）蒸馏水                                    1 min

（7）苏木精液染色                            5-15 min 

(8 ) 流水稍洗去苏木精液                         1-3 s

(9) 1%盐酸乙醇                                 1-3 s

(10) 稍水洗                                   10-30 s

(11)促蓝液返蓝                               10-30 s

(12) 流水冲洗                               10-15 min

（13）蒸馏水过洗                                 1-2 s

HE制片是病理医生用作病理诊断的基本和重要的依据之一，病理技术员的责任就是为病理医生提供高质量的HE制片。一张高质量的HE制片要做到：（1）切片完整、贴片恰当。（2）切片较薄和均匀。（3）无皱折。（4）无刀痕。（5）染色清晰、核浆分明、透明度好。（6）无固缩、龟裂、污染。（7）封胶适当、玻片清洁。（8）标签号码清楚，字体端正。