血友病之声
血友病是由于遗传性凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）基因缺陷，造成血浆FVIII和FIX含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII缺乏）和血友病B（FIX缺乏），属X性联隐性遗传性疾病。西方国家血友病患病率为5-10/10万人口，我国2.73/10万人口。自70年代以来，随着有效的替代治疗，血友病致残率与死亡率大大降低，发达国家血友病患者的寿命已从50年代的平均10岁提高到接近正常水平。80年代后，随着病毒灭活技术的不断改进，替代治疗的安全性得到保障，血友病患者感染病毒性肝炎，爱滋病大大降低。进入90年代以来，重组凝血因子的广泛应用，不仅提高疗效，同时避免了传统人源性凝血因子应用后产生抗体与易发生病毒感染的副作用。基因治疗在动物试验中获得成功,在人类的临床初步研究成果为血友病的根治带来曙光。如何进一步降低血友病患者的死亡率，致残率，出生率，提高患者生存质量是目前工作的重要任务。本文仅就血友病近年研究进展进行概述。
一．发病机制的研究
FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。已发现约300多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的FVIII缺乏和临床表型。已证实FVIII 22内含子倒位突变引起FVIII严重缺乏是45%的重型血友病A的分子发病机制。最近在1%的重型血友病A中还发现FVIII内含子1倒位突变。
二．基因诊断：确定致病基因；用于携带者检出和产前诊断；并可预测抑制物的产生。
（一）直接基因诊断：采用分子生物学方法(PCR，DGGE，SSCP，DNA测序等)直接测定致病基因的缺陷。FVIII 22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，也是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FVIII 22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。
（二）间接基因诊断：利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99%。RFLP分析的局限性：必须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个RFLP才可诊断。
（三）产前诊断：对高危胎儿可在妊9-12周通过绒毛膜活检；妊12-16周进行养水穿刺，近来还可在胚胎植入前通过早期胚胎（8个细胞时）获取胎儿DNA，通过DNA基因型和遗传表型确定胎儿性别，以及进一步判断是否为血友病或携带者。妊18-20周可在胎儿镜下取脐静脉血，测定FVIII:C和FVIII:Ag。上述方法都存在流产的危险（约0.5%-1%）, 需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术（FACS）测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期，无创性产前诊断的方法。
三．替代治疗：是目前最有效的治疗手段。主张尽早治疗，将凝血因子提高到止血水平，避免出血并发征，防止功能丧失。但目前全世界尚有80%患者没有任何替代治疗。血浆制品的产率仅5%-10%，随血源紧张将越来越匮乏与昂贵。
），血浆筛选的规范化（PCR），血制品的安全性大大提高，血源传播性疾病如肝炎，爱滋病发生率明显降低。¯，二步病毒灭活法-HAV¯，有机溶剂加表面活性剂方法-HCV¯（一）人FVIII浓缩物：近15年随着病毒灭活技术的改进（干热法-HIV
中纯度：含FVIII 1-3U/mg，每1U/kg可使血浆FVIII水平提高2%，含VWF，也可用于VWD治疗。体内半寿期为8-12小时。副作用：病毒感染，抗FVIII抑制物产生。
高浓度：含FVIII 50-200U/mg，利用层析技术制备，不含VWF。
超高纯度：含FVIII 3000U/mg，利用离子交换层析或单克隆抗体技术制备，不含VWF，
主要用于FVIII抑制物(中高滴度, 10-30BU)的治疗。
（二）重组FVIII浓缩物（rFVIII）：通过基因克隆技术表达，1990年通过美国FDA批准，其生物活性，半寿期与血浆FVIII相似，安全，无病毒污染。但价格昂贵，也可产生抗体。目前在加拿大与爱尔兰几乎所有血友病患者，美国70%以上重型HA采用rFVIII治疗。主要用于重型血友病A和抑制物的治疗。
第一代rFVIII（全长FVIII）：利用人体白蛋白作为稳定剂。
第二代rFVIII（BDD）：利用蔗糖代替蛋白作为稳定剂，FVIII无B区，但仍保留其活性，生化特性基本同血浆制品。由于不含其他人类蛋白，无免疫活性，更安全，有效。使用BDD时，一期法FVIII：C测定低于正常50%，推荐二期法或发色底物法可得理想结果。
第三代rFVIII：利用鼠单抗，不含人和动物蛋白，尚处临床试验阶段。未来若干年内，转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。
（三）猪FVIII浓缩物：多数抑制物对猪FⅧ的亲和性比对人FⅧ亲和性差，不易与人FⅧ抗体发生交叉反应,，用于高反应型抑制物且严重出血患者的治疗。付作用：轻度发热，皮疹，血小板减少（5%-10%），多与剂量有关，偶尔有变态反应，未经病毒灭活。猪与人FⅧ有交叉免疫性，约30%产生抗猪FⅧ抗体，造成耐药。强调开始足量，迅速降低抗体，抗体滴度<5BU：50u/kg；5-30BU：75-100u/kg；>30U：100-150u/kg 。最近重组的猪FVIII进入一期临床试验：重组人-猪FⅧ混合物利用抗原性较弱的无B区的猪FVIII序列替代人FVIII A2，活化的肽-A3和C2序列，以降低免疫原性与抗原性，可望成为治疗抑制物的新制剂。
（四）FVIII旁路制剂-不依赖FVIII/FIX的止血的制剂
其作用原理是绕开内源性凝血途径，通过补充外源或共同凝血途径中所需的凝血因子同样可达到凝血终点。
（1）凝血酶原复合物(PCC)：含FII，FIX，FX和FVII，主要用于血友病B的治疗。PCC (无肝素)还被作为“旁路制剂”广泛用于产生FVIII抑制物患者出血的治疗，75-125U/kg/次，有效率50-60%。可引起血栓，长期制动如术后患者不主张用。1974年国际血栓与止血委员会建议每ml PCC中加入5-10U肝素以防止血栓。
（2）激活的凝血酶原复合物(APCC)：含一定量的“FⅧ抑制物旁路活性“（Factor eight inhibitor bypassing activity，FEIBA）的PCC（亦称抗抑制物凝血复合物），已有两种产品Autoplex”(Batex hyland) 50U/kg和FEIBA(Immuno)，50-75U/kg，q8-12h。用于产生抑制物的血友病A出血的治疗，有效率达40%-60%。副作用：血栓发生率为1%-2%，反复大量使用，肝脏病，抗凝血酶缺乏时易发生，如使用3-4次后无效，则不应再用。
（1） 重组激活的FVIIa (rVIIa)：一种新的“旁路制剂”，通过直接或与受损部位的组织
因子结合成复合物，与暴露在激活的血小板表面带负电荷的磷脂结合后，直接激活FXa；同时还可激活FIX成为FIXa，促进凝血酶形成，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，达到局部止血。这种酶促反应局限在细胞表面，可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险。推荐剂量为90ug-120ugkg-1，静脉注射，q2-3h, 重复2-4次（rVIIa 半寿期仅2-3小时），直至止血。rVIIa治疗有抑制物的患者的自发性出血或预防大手术的严重出血有效率达80%-90%，还可用于无抑制物HA，HB患者及伴有FIX抑制物者，遗传性FVII缺乏者出血的治疗，一般剂量为35- 70u/kg/次，有效率达80%。rVIIa使用安全，一般无需实验室监测。注射局部可形成血栓性静脉炎，极少发生血栓与DIC，但已有心肌梗死的报道。禁忌：已知对rVIIa和鼠，牛蛋白过敏者。缺点：价格昂贵。
五．其它治疗：
（一）DDAVP (弥凝 Stimate)：是一种血管加压素的衍生物(1-精氨酸-8-血管加压素)，介导FVIII，VWF，纤溶酶原激活物从内皮细胞迅速释放到循环中，释放的VWF结合FVIII，使FVIII静脉注射后增高约2-3倍。重复用药至少应间隔24小时以上，因为储存需要再充实。最早用于20世纪70年代末，80年代HIV流行时在意大利被广泛应用，可避免应用生物制剂病毒感染，抗体产生。剂量：0.3-0.4ug/kg+30ml生理盐水， 15-30分钟输完，也可鼻饲。副作用：很轻且短暂，如注射中面色发红，心率加快，轻度头痛，鼻塞。水潴留很少见，
适应征：轻型血友病A，血友病携带者和1型VWD首选。中，重型HA和2型VWD无效。禁忌征：2B型和假性VWD，由于大的VWF多聚体的突然释放，与血小板亲合力增加而引起血小板聚集性增高，或血小板与大的多聚体的结合引起血小板减少。心绞痛，心衰，妊娠禁用。5岁以下儿童慎用。
射线“切除”增殖的滑膜和血管，可减少关节出血率，促进功能恢复。成功率约80%，疗效接近关节镜滑膜切除，简单，安全，只需少量替代治疗。适应征：慢性血友病滑膜炎，关节反复出血，6个月内出血超过3次，无明显关节软骨及骨质破坏，关节功能I-II级，替代治疗效果不佳的血友病患者。5岁以下儿童慎用。b（二）早期慢性滑膜炎的非手术治疗：经验来自同位素治疗风湿性关节炎。采用32P关节腔内注射，利用
（三) 血友病的继发性疾病
病毒感染并发症：1985年以前，多数接受浓缩物治疗的血友病患者感染HIV，乙肝（HBV），丙肝病毒（HCV），直至近几年献血员筛选及病毒灭活得到改善。
1． 肝脏病变：HCV，HBV感染发展成慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎（50%），肝硬
化（10%-20%），肝癌发生率高于一般人群30倍。肝功能衰竭已成为血友病患者死亡的不可忽视的原因之一。HCV治疗同非血友病患者的肝炎，α干扰素及病毒唑合用，约1/2获得长期缓解。国外对少数失代偿性肝硬化血友病患者进行肝移植，移植的肝脏产生一定的FVIII或FIX，因此血友病同时得到改善。少数患者HCV合并HIV感染，治疗棘手，死亡率大大增加。
2．获得性免疫缺陷病（AIDS）：1978-1985年，90%重型HA感染HIV，AIDS成为血友病死亡的主要原因（占65%）。HIV感染引起继发性免疫缺陷，卡波氏瘤增加200倍，非霍奇金淋巴瘤增加29倍。1985年以来，随着严格献血员筛选，病毒检测及病毒灭活技术（加热法，有机溶剂加表面活性剂，亲和层析法，二步法病毒灭活）的不断改进，现已基本消除感染HIV的危险，血制品的安全性与有效性得到大大提高。治疗同其它非血友病AIDS患者。
二．伴有抑制物血友病A的治疗：个体化，经验性治疗。
FⅧ抑制物是临床最常见的引起出血的凝血因子抑制物,1940年报告了首例获得性血友病。80年代以前，伴有抑制物的血友病患者治疗棘手，死亡率较高。目前随着FⅧ“旁路制剂”的应用，使患者的预后大大改观。
[抑制物产生的流行病学与危险因素]
HA患者接受含有FⅧ的血制品替代治疗后产生的特异性抑制或灭活FⅧ促凝活性的抗体，发生率占HA 20%-30%，95%的抑制物发生在中重型。抑制物产生的平均时间为暴露于抗原后50天内（中位数5-16天）。1/3抑制物为一过性，无临床意义。80%为高反应型。多发生于儿童（10岁以前）。有阳性家族史，某些种族（如非洲人种），免疫应答反应强者发生抑制物危险性较高。近年发现抑制物产生与基因关系密切，大片断基因缺失（约占30%），无义突变（约占25%）；22内含子基因倒位（约占20%-30%），终止密码子引起FⅧ蛋白缺失，抑制物的发生率占35%，而小的基因缺失，错义突变，剪切点突变致FⅧ蛋白存在,但活性丧失，这种抑制物的发生率仅占5%-10%。因此可见，基因突变类型可成为临床预测抑制物发生的危险因素之一。 较重要的突变往往缺乏FVIII抗原（CRM-），重型患者由于体内基本无FVIII蛋白（抗原）的合成与分泌，替代治疗采用的FVIII则成为异体蛋白（抗原），诱导免疫反应，产生同种免疫抗体。轻中型HA可合成和分泌无功能活性的FVIII蛋白，因此部分患者可形成免疫耐受，抗体发生率低（3%-13%）。但某些CRM+错义突变的轻中型HA也是抑制物产生的危险因素。引起稳定的FVIII分子异常的突变（如Cys残基可导致异常二硫化键形成）是抑制物产生的最危险因素。
5BU/ml），反应迅速，强烈，多有免疫记忆，再次暴露于抗原后（3-7天）抗体可显著升高，持续时间长，甚至达1-2年，占75%。总之，抗体产生机制复杂，尚未完全清楚，与治疗的强度，制剂有关。>5BU/ml），反应慢，可一过性的，多在4-12周自行消失，再次暴露于抗原后并不升高，25%HA为此种类型。高反应型-抗体滴度高（<根据抑制物免疫应答反应分为：低反应型-抗体滴度低（
非HA患者产生的FⅧ抑制物是一种自身抗体（或称自发性获得性FⅧ抑制物，获得性血友病），由于体内多种抗体与FⅧ有交叉反应性而产生，发生率为1/100万，可自行消失，多在60岁以后发病，50%伴有自身免疫性疾病（SLE，类风湿关节炎），此外药物(如青霉素，α-干扰素等)，恶性肿瘤，支气管哮喘，皮肤病，GVHD患者，妊娠或分娩后，甚至健康老人中也可产生。
[抑制物的免疫生物学特性]
FVIII抑制物属多克隆高亲和性的免疫球蛋白，多IgG（自身抗体大多为Ig1, Ig4），少数IgM， IgA或混合型。针对不同抗原决定簇，产生不同抗体。其合成依赖对 |
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